Débuter en Microscopie : les notions de base

Après avoir identifié chaque élément du microscope, il convient de bien comprendre un certain nombre de notions.

Le grossissement :

Le grossissement final d’un microscope se calcule en multipliant le grossissement de l’objectif (ex. 4x, 10x, 40x, 100x) par le grossissement de l’oculaire (ex. 10x). Ainsi, lorsqu’on enclenche l’objectif 40x d’un microscope équipé d’un oculaire 10x, le grossissement final est de 400x (40 x 10 = 400).

Gobjectif x Goculaire = Gfinal

La préparation :

La plupart du temps, les échantillons ne peuvent être observés directement. On observe en fait une préparation. Il convient d’en extraire une lame mince qui sera placée (dans un milieu liquide) entre lame et lamelle (couvre-lame). Le tout sera ensuite déposé sur la platine du microscope de telle sorte que la lumière traverse l’échantillon avant d’atteindre l’objectif du microscope. Certains modèles, tels que les microscopes métallurgiques, sont capables d’observer des échantillons sans préparation mais ils sont rares et très spécialisés. Ils ne conviennent généralement pas aux observations standards.

Réglage de l’écartement inter pupillaire :

Dans le cas des microscopes munis de deux oculaires, il est nécessaire de régler l’écartement entre ceux-ci pour l’adapter à la morphologie de l’observateur et plus précisément à l’écart entre ses pupilles. Il suffit d’approcher ses yeux des oculaires (sans nécessairement les toucher) jusqu’à observer deux cercles lumineux. Il faut ensuite régler l’écartement entre les tubes porte-oculaires jusqu’à ne plus observer qu’un seul cercle de lumière. L’axe des oculaires est alors aligné avec celui de vos yeux.

Mise au point :

Pour obtenir une image nette au niveau des oculaires, il convient d’effectuer une mise au point. Pour cela, nous allons placer une lame préparée sur la platine du microscope et allumer le système d’éclairage transmis (dans le pied). Il est plus simple de commencer à faible grossissement, nous allons donc faire tourner la tourelle porte-objectifs jusqu’à positionner l’objectif 4x au-dessus de la préparation. Il faut, ensuite rapprocher l’objectif le plus près possible de la lame à l’aide des molettes de mise au point, en surveillant, à l’œil nu, qu’ils ne se touchent pas. On positionnera ensuite nos yeux au niveau des oculaires et on manipulera les molettes de mise au point en sens inverse de façon à écarter lentement la préparation et l’objectif jusqu’à observer une image nette. Il est alors possible de jouer sur les mollettes de mise au point pour observer plus ou moins profondément au sein de l’échantillon (cf. “profondeur de champ” ci-après).

Il est ensuite possible de répéter cette opération avec les autres objectifs pour atteindre des grossissements plus forts. On peut également faire bouger la préparation sous l’objectif pour en explorer la surface. Cela peut se faire manuellement ou à l’aide de molettes de mouvements orthogonaux si celles-ci sont présentes.

Il est à noter que les objectifs 100x doivent être utilisé “en immersion”. On utilise alors une goutte de liquide (le plus souvent de l’huile) pour faire la jonction entre la lamelle et l’objectif afin d’obtenir une image nette et contrastée. Cette pratique fera l’objet d’un article séparé.

Réglage dioptrique :

Afin de s’adapter au mieux à la vue de l’utilisateur, de nombreux microscopes sont équipés d’une molette de réglage dioptrique sur au moins l’un des deux oculaires. Pour effectuer ce réglage : effectuer la mise au point normalement en gardant fermé l’œil correspondant à l’oculaire comportant une molette de réglage dioptrique (si le microscope n’en comporte qu’une). Une fois, cette mise au point effectuée, inverser l’ouverture de vos yeux et affiner la mise au point sur l’autre oculaire en jouant sur la molette de réglage dioptrique.

La distance de travail :

Il s’agit de la distance entre la préparation et l’objectif à laquelle se fait la mise au point. Elle dépend d’un paramètre appelé « ouverture numérique ». Souvent abrégée en « WD » pour « Working Distance » en Anglais, c’est une caractéristique de l’objectif et on peut souvent lire sa valeur directement sur celui-ci.

La profondeur de champ :

On désigne par ce terme l’épaisseur de l’échantillon sur laquelle on a une image nette. Les parties de l’échantillon situées au-dessus et au-dessous de la zone de mise au point restent floues. Il s’agit d’une sorte de « plan de netteté » qu’il est possible de faire varier en jouant sur les molettes de mise au point. Plus le grossissement est grand, plus la profondeur de champ est réduite.

Champ observé

Le champ observé, ou plage d’observation, dépend de l’indice de champ de l’oculaire et correspond sur l’échantillon au diamètre (en millimètres) de la zone que vous pouvez voir à travers les oculaires. L’indice de champ des oculaires est indiqué par la deuxième valeur des caractéristiques de l’oculaire. Ainsi, des oculaires «  10x/22 » ont  un indice de champ de 22mm. Pour calculer le champ final observé, il suffit de diviser l’indice de champ de l’oculaire par le grossissement de l’objectif utilisé. Si un microscope possède des oculaires qui ont un indice de champ de 20, avec l’objectif 4x (par exemple) le diamètre de la zone observée sera égal à 20mm / 4x = 5mm.

Indice de Champ / Grossissement Oculaire = Champ Observable

Par conséquence, plus le grossissement est important, plus le champ observable est réduit.

Ouverture numérique :

Cette dimension sans unité caractérise les objectifs de microscope. L’ouverture numérique (O.N.) représente la gamme d’angles pour laquelle l’objectif est capable d’émettre et de recevoir de la lumière. Ce paramètre influence la distance de travail (Working Distance : W.D.), la profondeur de champ et le pouvoir séparateur de l’objectif.
Plus l’ouverture numérique est élevée, plus la distance de travail et la profondeur de champ sont faibles et plus le pouvoir séparateur est important.

Le pouvoir séparateur ou résolution :

Cette valeur représente la capacité d’un objectif à distinguer deux points distincts et est définie comme la distance angulaire minimale entre deux éléments qui permet d’en obtenir deux images distinctes. La résolution maximale qu’il est possible d’obtenir aujourd’hui en microscopie optique est de 0,24 µm, c’est-à-dire que l’on peut distinguer sur un échantillon deux points distants l’un de l’autre de 0,24 µm. Si deux points sont plus rapprochés, ils seront alors vus comme un seul.

Les aberrations chromatiques et sphériques

La lumière est une onde électromagnétique possédant différentes caractéristiques dont la longueur d’onde. A chaque couleur, correspond une longueur d’onde donnée. Lors de la traversée d’une lentille, la lumière blanche se décompose en ses différentes longueurs d’ondes (en différentes couleurs) et celles-ci ne se projettent pas sur le même plan focal. C’est ce que l’on appelle une aberration chromatique. Certains objectifs sont fabriqués pour corriger cette aberration, on les appelle objectifs achromatiques (corrigés sur deux couleurs) et apochromatiques (corrigés sur trois couleurs).

Un autre type d’aberration rencontré est ce que l’on appelle l’aberration sphérique : lors d’une observation au travers d’une lentille, on peut remarquer des courbures anormales sur les bordures du champ observé alors qu’au centre l’observation reste plane. Pour corriger cette aberration optique on peut utiliser des objectifs dits semi-plans (planéité sur 90% de la surface) ou plans (planéité sur 100% de la surface). Bien évidemment, plus un objectif corrige d’aberration, plus son prix est élevé.

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